1.完成半乳糖化海藻酸钠（G-SA）的合成与表征
1.1 半乳糖化海藻酸钠合成
称取0.15 g海藻酸钠溶于40 mL MES(0.2 M, pH 4.5)缓冲液中，搅拌3小时至完全溶解。加入17.5 mg NHS和363.05mg EDC（摩尔比EDC: COO-=2.5，NHS:EDC=0.2），室温搅拌30 min至均匀。加入245.1 mg半乳糖胺盐酸盐（摩尔比Gal：monosaccharide=1.5），室温反应24 h。反应产物置于截留分子量为10000的纤维素透析袋（广州菲薄生物科技有限公司）中，用去离子水透析3天，冻干。
1.2 半乳糖化海藻酸钠结构表征
FTIR 测试：取一定量的样品与溴化钾混合，研磨，采用溴化钾压片法，在 Nicolet/Nexus 670 FT-IR Analyzer（Nicolet Co., USA）上进行FTIR表征，扫描次数为 64 次，扫描范围为 400-4000 cm-1，分辨率为 4 cm-1。
1H NMR 测试：G-SA 溶于重水，利用 400 兆超导核磁共振谱仪 (Superconducting Fourier Transform Nuclear Magnetic, Bruker AVANCE 400)对样品结构进行 1H NMR 表征。
海藻酸钠和 G-SA 的氢谱
海藻酸钠和 G-SA 的红外谱图
2. 生物墨水制备
比例如下：table1 2
Table 1 Different composite of Bioink 1
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Bioink
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SA（g）
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Gelatin（g）
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H2O（mL）
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A
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0.4
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0
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10
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B
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0.4
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0.6
|
10
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|
C
|
0.4
|
0.8
|
10
|
|
D
|
0.4
|
1.0
|
10
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|
E
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0.4
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1.2
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10
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Table 2 Different composite of Bioink 2
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Bioink
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G-SA（g）
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Gelatin（g）
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H2O（mL）
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A
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0.4
|
0
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10
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B
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0.4
|
0.6
|
10
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|
C
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0.4
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0.8
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10
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D
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0.4
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1.0
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10
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|
E
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0.4
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1.2
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10
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3. 支架打印
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气压（Mpa）
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填充间距（mm）
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针头（G）
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层数
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Bioink 1-C
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0.5
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1.5
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22
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6
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Bioink 2-C
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0.5
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1.5
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22
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6
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4. 打印支架溶胀率表征
实验步骤：打印好的支架经冷冻干燥 24 h 后取出，天平称取质量记录 Wd，置于 5 ml PBS 中，记录 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 24 h的 质量记录 Ws。
5. 肝细胞培养实验
5.1 构建含绿色荧光蛋白的肝细胞（LO2）稳转细胞系
培养LO2细胞，待细胞长至80%~90%消化细胞并计数，按5*105cells/孔的细胞密度接种细胞到6孔板中；第二天换带有8 ug/ mL polybrene的完全培养基并以MOI=50（根据不同细胞而定）加入慢病毒；第三天换成完全培养基培养，48 h 后消化细胞并以1：2传代，细胞贴壁后按2ug/ mL（不同细胞浓度略有差异）的浓度加入 puromycin 做筛选，每2~3天换液（带2ug/ mL 的 puromycin 完全培养基）；等细胞长满后消化细胞扩大培养，即可获得带绿色荧光蛋白的 LO2 稳转细胞。
5.2.荧光显微镜观察微凝胶与 LO2 稳转细胞系共培
培养含绿色荧光蛋白的稳转 LO2 细胞系，待细胞长至80%~90%消化细胞并计数，按5*105cells/孔的细胞密度接种细胞到 6 孔板中；取相同量的Gel-1海藻酸钠和Gel-3半乳糖化海藻酸钠微凝胶，分别加入对应的 6 孔板培养；分别于24小时和48小时后于倒置镜荧光显微镜(OLYMPUS IX71)观察两组的细胞
总结：已找到最合适的墨水配比，优化了打印条件，细胞增殖实验证明半乳糖化海藻酸钠水凝胶支架的优良性能，后续细胞实验将有序开展。
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