一、项目实施情况:
项目目标任务:
解决肝细胞在常用的培养基质表面的黏附主要受整合素受体和配体作用介导导致使肝细胞在基质表面过度铺展,丧失正常表型的问题。构建细胞负载水凝胶肝组织模型,探究体外构建器官的影响因素和注意事项。
完成情况:
成功制备制备三维水凝胶支架并促进肝癌细胞增殖生长。
实施过程:
1.半乳糖化海藻酸钠(G-SA)的合成与表征
1.1 半乳糖化海藻酸钠合成
称取0.15 g海藻酸钠溶于40 mL MES(0.2 M, pH 4.5)缓冲液中,搅拌3小时至完全溶解。加入17.5 mg NHS和363.05mg EDC(摩尔比EDC: COO-=2.5,NHS:EDC=0.2),室温搅拌30 min至均匀。加入245.1 mg半乳糖胺盐酸盐(摩尔比Gal:monosaccharide=1.5),室温反应24 h。反应产物置于截留分子量为10000的纤维素透析袋(广州菲薄生物科技有限公司)中,用去离子水透析3天,冻干。
1.2 半乳糖化海藻酸钠结构表征
FTIR 测试:取一定量的样品与溴化钾混合,研磨,采用溴化钾压片法,在 Nicolet/Nexus 670 FT-IR Analyzer(Nicolet Co., USA)上进行FTIR表征,扫描次数为 64 次,扫描范围为 400-4000 cm-1,分辨率为 4 cm-1。
1H NMR 测试:G-SA 溶于重水,利用 400 兆超导核磁共振谱仪 (Superconducting Fourier Transform Nuclear Magnetic, Bruker AVANCE 400)对样品结构进行 1H NMR 表征。
图 1 海藻酸钠和 G-SA 的氢谱
图 2 海藻酸钠和 G-SA 的红外谱图
2. G-SA 对细胞粘附的促进能力考察
2.1 不同浓度 G-SA 对细胞粘附行为的影响
分别称取0.1g,0.5g,1g,2g,3g,4g的 G-SA并溶于超纯水,完全溶解后紫外照射 30 min。取 100 ul G-SA溶液涂布在24孔板底部,在紫外照射下放置24h风干。将培养至融合期的 HepG2 细胞以 1 x 104个/ml接种至孔板,进行1,3,7天培养并进行荧光染色计算细胞数量。
图 3 不同浓度 G-SA 对细胞增殖粘附的影响
图 4 imageJ 计算不同天数不同浓度细胞数量
图 5 CCK-8测定不同浓度 G-SA 培养七天后OD值
如上图3、4、5表明,低浓度的G-SA对细胞粘附增殖具有促进作用,高浓度会抑制细胞的生长行为。考虑到可打印性,因此后续采用了1%浓度作为打印墨水。
G-SA可打印性表征
图 6 打印墨水损耗模量和储存模量表征
墨水比例如下:table1 1
|
G-SA/SA(g)
|
Gelatin(g)
|
H2O(mL)
|
实验组
|
0.1
|
0.4
|
10
|
空白组
|
0.1
|
0.4
|
10
|
2. 支架打印
|
气压(Mpa)
|
填充间距(mm)
|
针头(G)
|
层数
|
实验组
|
0.5
|
1.5
|
22
|
6
|
空白组
|
0.5
|
1.5
|
22
|
6
|
图 7 打印支架表观形貌
3. 打印支架溶胀率表征
实验步骤:打印好的支架经冷冻干燥 24 h 后取出,天平称取质量记录 Wd,置于 5 ml PBS 中,记录 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 24 h的 质量记录 Ws,溶胀率公式如下:
图8 打印支架溶胀率
后续还将继续完善细胞在三维支架上的生长增殖情况考察,通过CCK-8测定细胞在支架上的增殖情况;活死染色探究细胞在支架上的细胞活性;激光共聚焦拍摄细胞在三维支架上的空间分布情况。
二、项目创新点与特色:
3D打印技术个性化的定制,可符合不同病损部位的 需求。通过在海藻酸钠分子上接枝半乳糖,实现对肝癌细胞粘附增殖的促进作用,同时利用3D打印技术利用水凝胶材料制备组织工程支架,接种细胞以实现体外构建肝脏组织和肿瘤模型。
1、本课题在海藻酸钠分子上接枝半乳糖,增强了材料与细胞间的相互作用,生物相容性好。
2、本课题使用3D打印方法制备半乳糖化海藻酸钠支架,实现个性化定制。
3、本课题使用3D打印半乳糖化海藻酸钠支架接种肝癌细胞,有进一步构建体外肿瘤模型的潜力。
三、项目成果:
项目申请书中的预期成果及成果提交形式
公开发表论文:1(篇),专利:0(项),调查报告:0(份),软件、著作:0(份)实物:1(件),竞赛获奖:0(次),其它:
项目结题时取得的成果
公开发表论文:1(篇),专利:0(项),调查报告:0(份),软件、著作:0(份)实物:1(件),竞赛获奖:2(次),其它:
项目主要研究成果情况
序号 | 成果名称 (获奖名称及等级) | 成果形式 | 作者(获奖者) | 出版社、发表刊物 或颁奖单位 | 时间(刊期) |
1 | 华侨大学第28届挑战杯学生科技作品竞赛特等奖 | 竞赛获奖 | 吴冰 吴峻毅 胡龙歌 | 华侨大学 | 2021.1 |
2 | 参加第五届全国大学生材料设计邀请赛获三等奖 | 竞赛获奖 | 吴冰 吴峻毅 胡龙歌 | 厦门大学 全国大学生创新创业实践联盟 | 2021.5 |
3 | 《3D打印海藻酸钠基功能材料的研究进展》 | 论文(已接收未见刊) | 吴冰 | 《高分子通报》 | 2021.4 |
四、研究体会和心得:
从2020年6月份开始,我们小组开始了省级大学生创新创业训练计划项目。指导老师是我校材料科学与工程学院的王士斌老师和傅超萍老师。在老师们的指导和支持下,经过不断地摸索与努力,我们逐步目标明确,方案清晰,渐入佳境,从项目中收获了很多宝贵经验。回想过去参加研究项目的过程,从开始的寻找课题到申请立项撰写项目申请书,到查阅相关参考文献,确定实验项目、实施方案和寻找创新点;并制定详细的研究方案和步骤;对项目进行相关调查和研究;到最后确定项目的可行性,一步步走来,其中的经验和成长只有经历过才会分享和拥有。这期间,最深的体会就是要善于勤于思考,主动动手动脑。不要着急,一点点一步一步地来,先查阅文献资料,弄明白其中原理,再勤于思考,在文献资料中获得有用的信息,得到启发,然后再运用到自己研究的项目中。
五、经费使用明细情况:
项目获批总经费:10000(元),项目实际投入经费:10000(元),实际使用资金:10000(元),结余资金:0(元)
项目经费开支情况
名目 | 用途 | 金额(元) | 备注 |
论文版面费 | | | |
专利申请费 | | | |
调研、差旅费 | | | |
打印、复印费 | | | |
资料费 | | | |
试剂等耗材费 | 药品试剂,烧杯等实验耗材 | 10000 | |
元器件、软硬件测试、小型硬件购置费 | | | |
其它 | | | |
指导教师意见:
从选题、实施、研究到结题,该小组同学积极主动地参与课题研究活动,能及时将自己的活动过程和情况反馈,与指导老师经常保持联系。该小组员能较好地分工合作,基本达到研究目的,取得了比较好的研究结果,经费使用合理,同意结题。