一、项目实施情况:
1、项目执行过程情况
合成可被X射线激发的镧系稀土纳米粒子;对纳米粒子进行表征;在纳米粒子表面修饰核酸适配体和荧光猝灭基;用修饰适配体纳米粒子检测生 物样品中的甲胎蛋白AFP;检测灵敏度并验证分析原理。项目完成情况良好,取得一定的成果。
2、项目计划内容与完成情况比对
1) 合成NaGdF4:Tb(xmol%;x=5,10,15,20和25)核纳米粒子:在用于合成NaGdF4:Tb(x mol%;x=5,10,15,20,和25)的典型步骤中,总量为0.5 mmol。 将Ln(CH3COO)3·4H2O(Ln=Gd和Tb)添加到含OA 4 mL和ODE 16 mL的50 mL三颈圆底瓶中。在真空中加热至150 ℃,搅拌45 min溶解固体Ln(CH3COO)3·4H2O。冷却至室温后,加入含有1.8 mmol NH4F和1.8 mmol NaOH的10 mL甲醇溶液。在50 ℃下搅拌30 min,然后在100 ℃下加热10 min。在此基础上,进行脱气10 min,蒸发溶剂中残留的甲醇和氧气。所得溶液在氮气气氛中以10 ℃/min的速度加热至295 ℃,加热1.5 h,冷却至室温后,产物析出。用乙醇洗涤,6000 rpm离心10 min,重复多次,最后分散在4 mL的环己烷中。
2) NaYF4核/壳纳米粒子的合成:Tb(15 mol%)@NaYF4核/壳纳米粒子:通过外延生长制备了核/壳稀土纳米粒子。合成的核纳米粒子NaGdF4:Tb(15 mol%)用作惰性壳生长的种子。将0.5 mmol的Y(CH3COO)3·4H2O添加到含有4 mL OA和16 mL ODE的50 mL三颈圆底瓶中。抽真空加热至150 ℃。搅拌45 min,溶解固体Y(CH3COO)3·4H2O。冷却至50 ℃后,在混合液中加入NaGdF4:Tb(15 mol%)纳米粒子4 mL,在80 ℃下加热30 min,蒸发环己烷。随后,反应溶液冷却到室温。在合成液中加入含有1.8 mmol NH4F和1.8 mmol NaOH的10 mL甲醇。所产生的混合物在50 ℃加热30 min,100 ℃加热10 min。在此基础上,进行脱气10 min,蒸发溶液中残留的甲醇和氧气。随后,溶液以10 ℃/min的速率加热到295 ℃。氮气气氛1.5 h,冷却至室温后,用乙醇沉淀,6000 rpm离心10 min,乙醇洗净,最后分散在4 mL环己烷中用于进一步使用。
3) NaYF4纳米颗粒对NaGdF4:Tb(15 mol%)的无配体处理:将分散在环己烷中的纳米颗粒用乙醇沉淀出来,并以6000 rpm的转速离心10 min,弃去上清液。在沉淀中加入1 mL盐酸(2 M)。混合液经超声处理10 min,去除表面包覆的油酸配体,然后在20000 rpm离心15 min。所得产物用乙醇和水洗涤3次。再分散于蒸馏水中待用。
4) 柠檬酸盐包埋NaGdF4:Tb(15 mol%)@NaYF4纳米粒子的合成:制备的无配体NaGdF4:Tb(15 mol%)@NaYF4纳米粒子分散在5 mL柠檬酸钠溶液(0.2 M)中。超声处理60 min。然后20000 rpm离心15 min。所得产物用乙醇和水洗3次,再用蒸馏水分散。
5) 结合蛋白NaGdF 4:Tb(15 mol%)@NaYF 4纳米粒子的合成:用1 mM EDC和1 mM NHS在1 mL MES缓冲液(10 mM,pH=6.0)中加入1 mg柠檬酸盐包埋纳米粒子,室温下活化1 h。将活化的纳米粒子收集后用H2O洗涤3次。所得沉淀物分散在1 mL HEPES缓冲液(10 mM,pH=7.2)中。在混合物中加入100 μL的亲和素(1 mg/mL)。室温下再孵育6 h。然后,以10000 rpm离心10 min,收集亲和素结合纳米粒子。最后,生成的产品用水洗3次,在HEPES缓冲液中再分散。
6) Ab2-Biotin与亲和素结合的NaGdF 4:Tb(15 mol%)@NaYF 4纳米粒子:将10 μL的Ab2-生物素(1 mg/mL)加入到含有1 mL亲和素纳米粒中HEPES缓冲液中,室温下孵育4 h。然后,将Ab2纳米粒子8000 rpm离心10 min。最后用H2O洗涤3次,在HEPES缓冲液中进行再分散。制备的纳米粒子储存在4 ℃环境中供进一步使用。
应用X射线荧光免疫分析法检测AFP:在PBS(10 mM,pH=7.2)中加入200 μL 2%的BSA溶液,在4 ℃下封闭磁珠(MB-Ab1)的非特异性结合位点,反应时间1 h,用PBS洗涤3次,再用磁性分离收集。然后,将不同量的AFP抗原标准溶液溶于200 μL PBS(10 mM,pH=7.2)中,在37 ℃下孵育1 h与AFP抗原偶联,用HEPES(10 mM,pH=7.2)洗涤3次,磁性分离收集。随后,加入200 μL Ab2-纳米粒子(200 μg/mL)。 在37 ℃下孵育2 h,然后用浓度为0.05%(v/v)的HEPES (pH=7.2)洗涤3次,用磁性分离收集。最后,用自主搭建荧光仪检测X射线激发发光光谱。
项目研究取得成果(成效)与应用:
(一)X射线荧光免疫分析的分析性能:以检测AFP作为评价X射线发光免疫测定的依据。AFP抗体结合磁珠(MB-Ab1)首先被牛血清所阻断,以避免非特异性相互作用。其次,AFP抗原通过高度特异性的结合亲和力与MB-Ab1结合。随后,加入Ab2修饰的NaGdF 4:Tb3+@NaYF 4纳米粒子 用X射线荧光光谱仪对检测结果进行了记录。如图一b和c,AFP抗原浓度在0.75-40 ng/mL范围内与X射线激发发光呈线性相关(R=0.997)。X射线发光免疫法检测限(LOD)低至0.25 ng/mL,更重要的是,可以通过应用更高功率的X射线来实现我们的工作中的较低的LOD。这种高灵敏度可能有助于自体荧光在X射线激发下。为了进一步检验免疫分析的生物学特异性,我们检测了几种常见的蛋白质,包括卵清蛋白(OVA)、前列腺特异性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)、人血清白蛋白(HSA)。如图一d,我们的方法已经显示出对AFP生物标记物进行特异性测定的能力。
(二)人血清样品监测及方法准确性评价:在实际生物检测中,我们比较了紫外光和X射线激发下的自荧光背景。如图二,与紫外光激发下的荧光相比较,X射线照射下血清样本几乎没有自体荧光。CCK-8分析表明,即使在较高浓度的纳米粒子下,对细胞活性也没有影响。表明NaGdF 4:Tb@NaYF 4纳米粒子具有良好的生物相容性。在X射线和紫外激发下的活体成像也很明显.此外,我们对10例正常人和癌症患者血清标本进行AFP检测。如图一e,结果表明,本方法测定的甲胎蛋白浓度与市场化检测试剂盒相当。ELISA试剂盒(R=0.995)。为实际应用提供了可能性。
二、项目创新点与特色:
传统的荧光免疫分析的灵敏度受限于生物样品中存在的自体荧光。由于X射线不可激发生物样品发光,因此利用X射线作为激发光源检测血清中的甲胎蛋白可有效避免自体荧光的干扰,提高灵敏度。
三、项目成果:
项目申请书中的预期成果及成果提交形式
公开发表论文:1(篇),专利:0(项),调查报告:0(份),软件、著作:0(份)实物:0(件),竞赛获奖:0(次),其它:
项目结题时取得的成果
公开发表论文:1(篇),专利:0(项),调查报告:0(份),软件、著作:0(份)实物:0(件),竞赛获奖:0(次),其它:
项目主要研究成果情况
序号 | 成果名称 (获奖名称及等级) | 成果形式 | 作者(获奖者) | 出版社、发表刊物 或颁奖单位 | 时间(刊期) |
1 | SCI一区 | 论文 | 张奇钊(5) | Analytical Chemical | 2018.05.14 |
四、研究体会和心得:
经过大半年的努力,从合成到检测,从条件探索到最后的谱图分析,从原理到具体操作,虽然在课业繁重等的压力下,但我们整个课题完成情况良好,我们也从中体验到了科研的艰辛和喜悦,虽然免不了枯燥的重复操作,但每次表征的结果又给了我继续坚持的动力,也坚定了我们继续深造的勇气和信心。思想上,我们对科研的严谨性有了更深的理解,一点点条件的变化都可能导致整个实验的失败。在一次差点发生危险的操作失误中,我们对科研产生敬畏之心,我们体会到,科研工作犹如在刀尖上跳舞一样,虽然很优美,但一不留神就会使自己处于危险之中。那次失误,我们会铭记于心!学术上,我们第一次接触了纳米材料,对它的性质,应用和制备有了一定的认识。在其中,我们认识了稀土元素发光机理和大型仪器的检测原理,学会了查阅文献和阅读文献的技能,掌握了常用检测仪器的使用方法。同时,在与师兄师姐的交流中,我们对研究生的学习生活有了一定的了解。我想,这对我们明年的研究生考试会有很大的帮助。
经过这次科研训练,我们对未来有了更清晰的定位,最后,感谢那些帮助过我们的老师们和师兄师姐们。
五、经费使用明细情况:
项目获批总经费:20000(元),项目实际投入经费:20000(元),实际使用资金:20000(元),结余资金:0(元)
项目经费开支情况
名目 | 用途 | 金额(元) | 备注 |
论文版面费 | | | |
专利申请费 | | | |
调研、差旅费 | | | |
打印、复印费 | | | |
资料费 | | | |
试剂等耗材费 | 试剂等耗材 | 20000 | |
元器件、软硬件测试、小型硬件购置费 | | | |
其它 | | | |